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CD40
更新時間:2015-04-26   點擊次數(shù):1274次

 
CD40   
該試劑盒以 HRP標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物(HRP Streptavidin Conjugate,
HRP-SA)為基礎(chǔ),可用于檢測血液,細胞、組織
CD40抗原。該試劑盒
、特異性強、定性定位    、背景清晰。在所用的 CD40一抗與相
,用生物化二抗與一抗特異性    ,zui后加   HRP-SA,形成抗
應(yīng)靶抗原
原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復(fù)合物,顯微鏡下觀察成像。 
試劑盒所含試劑:
試劑A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(選用) 
試劑B 封閉
試劑C (*分裝)已稀釋的即用型一抗(2.5ml) 
試劑D (*分裝)生物素化       IgG 1支 
(濃度1.5 mg/mL,稀釋     1:300~1:500)50 μL+抗體稀釋液20ml 
(封閉用) 20 mL 
試劑E HRP-SA復(fù)合物1支(濃度1 μM,稀釋     1:50~1:200)100 μL 
試劑F DAB顯色液 5ml 
用戶自備試劑:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4) 

1.21g 
7.6g 

加蒸餾  800mL,濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4,zui后定容至1000mL 
TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積  ) 
2.抗原修復(fù)液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液) 
10mM pH6.0 檸檬酸
檸檬酸0.38g 
檸檬酸三鈉2.45g 
加蒸餾  900mL,濃鹽酸調(diào)pH值至6.0,zui后定容至1000mL 
或:0.5M EDTA修復(fù)液(pH8.0) 
EDTA·2H2O 186.1g 
加蒸餾  700mL,用10mM NaOH調(diào)pH值至8.0,zui后定容至1000Ml 
3. 
10 mL 
4. Tween 20 5 mL 
石蠟包埋組織切片
實驗步驟(建議方案):
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度 
1.烤片: 將待做切片
,于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr; 
3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次
2.脫蠟: 切片放
10 min; 
3.    : 切片經(jīng)下行酒精    ,無
乙醇2 min;75%乙醇2min,自來
5min,95%乙醇2次(每次2min),85%
,ddH2O洗2×2min; 
4.抗原修復(fù): 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復(fù),常采用高壓、微波(溫
度達到98~100℃)或酶消化修復(fù)法,室溫自然    ,自來
2min,TBS洗滌(2×2min)(
5步封閉。 
5.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育30 min; 
,ddH2O洗2×
1)* 注:有些抗原勿需修復(fù),
直接進
6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜; 
7.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min); 
8.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育10 min; 
9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育
30 min; 
10.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min); 
11.封閉: 滴加試劑Tween 20,37℃濕盒孵育封閉20 min; 
12.加HRP-SA: 滴加用試劑C稀釋的試劑E(1:50~200,終濃度5~20 nM),37
℃濕盒中孵育30 min; 
13.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min),TBS洗滌(2×5 min); 
14.顯色:應(yīng)用DAB溶液(試劑F)顯色; 
15.復(fù)染:自來
,復(fù)染,脫  ,透明; 
16.封片: 待組織標(biāo)本干后,用試劑
封片; 

17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。 
注意事項:
1. 修復(fù)后
,自來
,驟
。 
2. 
,用過的檸檬酸
用。 
3. 若試劑為微量濃    ,用前應(yīng)低速離心,將
著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS
,以便洗去組織上殘留的Tween 20,否則會
影響
。 
5. 如須復(fù)染細胞核,則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封
片。 
附1:
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液:檸檬酸
9.0)等等。 
(0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修復(fù)液(pH8.0 或
,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育
。 
,將脫蠟
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟
,TBS
20~30min后TBS
二、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加
切片架上,放
,中檔或
10~15min,取出微波

,自來
,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,
須自行調(diào)整。 
三、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至    ,將組織切片
,修復(fù)


,蓋上鍋蓋,待噴
1.5~2.5min即可脫離熱源,自
,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。
四、隔
不銹鋼高壓鍋中加自來
騰,將切片放
,微波盒中加
于微波爐中加熱至
,待噴
,
4~8 min即可
,自然
,取出切片。此方法適用
于較難檢測或核抗原的修復(fù)。 

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