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western blot的試驗過程及注意事項的材料
更新時間:2018-03-06   點擊次數(shù):945次

western blot的試驗過程及注意事項的材料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳搬運到硝酸纖維膜上。 
1)搬運緩沖液洗刷凝膠和硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml移液管在凝膠上來回翻滾去除一切的氣泡。 
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用搬運緩沖液浸濕),將凝膠夾在中心,堅持濕潤和沒有氣泡。 
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙依照廠家主張辦法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極。 
4)將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿搬運緩沖液以吞沒凝膠。 
5)依照廠家所示接通電源開端電泳搬運。 
6)搬運完畢后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量規(guī)范閃現(xiàn)時取出,記載下規(guī)范方位。 
3. 用100ml水洗刷纖維素膜,必要時可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。 
5. 室溫下,用PBS-Tween緩沖液洗刷薄膜。 
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣。 
7.袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊。 
8.混合:NGS(100微升),印跡緩沖液中的抗體(10毫升),加在裝薄膜的袋中,于室溫下?lián)u擺2小時(或4℃過夜) 
9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,分4次在一淺盤中洗刷薄膜,每次75ml。 
10. 將銜接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi),于室溫下?lián)u擺1小時。 
11. 按過程9洗刷。 
12. 參加抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS),于室溫下?lián)u擺。 
注意事項: 
western blot中搬運在膜上的蛋白處于變性狀況,空間結(jié)構(gòu)改動,因而那些辨認空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況能夠?qū)⒈磉_意圖蛋白的細胞或細胞裂解液中的一切蛋白物素化,再用酶符號親和素進行western blot。試驗中取膠和膜需帶手套。

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