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細胞培養(yǎng)的基本技術
更新時間:2019-07-17   點擊次數(shù):883次

    細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)技術也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。不論對于整個生物工程技術,還是其中之一的生物克隆技術來說,細胞培養(yǎng)都是一個*的過程,細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)??寺?。細胞培養(yǎng),既包括微生物細胞的培養(yǎng),細胞培養(yǎng)技術可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術*的環(huán)節(jié),而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來,所以可以說細胞培養(yǎng)技術是生物技術中zui核心、zui基礎的技術。

細胞培養(yǎng)的基本技術

一、清洗

    新采用和重新使用的培養(yǎng)器皿,都要嚴格清洗,以防各種有害物質對培養(yǎng)細胞損害。培養(yǎng)用的塑料器皿目前主要依靠進口,均已無菌密封包裝,可直接使用。對于塑料瓶蓋或膠塞等,可水中浸泡后用2%NaOH煮沸10~20min,自來水中浸泡和蒸餾水漂洗2~3次,晾干備用。細胞培養(yǎng)中的絕大部分器皿系玻璃制品,清洗過程為以下步驟。

1.  浸泡 新使用或重復使用的玻璃器皿須經(jīng)5%鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min,水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質,并消除其弱堿性。

2. 刷洗 浸泡后用軟毛刷和的洗潔精進行刷洗。

3. 酸浸 刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干,以免造成酸浸液稀釋,影響效果。將玻璃制品*浸泡入清潔液中24h。清潔液具有*酸蝕作用,操作過程需戴防護用具。

4. 沖洗 浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗,吸管需沖洗10min,器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上,不liu任何酸浸液殘跡,然后用蒸餾水漂洗2~3次,烘干備用。要求干凈透明,無油煙,不能殘liu任何有害物質及化學藥品等。

二、消毒

1. 包裝 器材經(jīng)清洗烤干或晾干后,先應嚴格包裝,然后再行消毒滅菌處理,以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2. 消毒 消毒滅菌隨物品的不同,而采用不同的方法。

(1)紫外線:主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進無菌室前或做完實驗后,均應開燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。

(2)消毒劑:操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用點酒、酒精消毒。無菌室內桌椅和物體的消毒可用0.1%新潔爾滅、過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。實驗室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸(高錳酸鉀5~7.5g,加40%甲醛10~15ml,混合放入一開放容器內,立即可見白色甲醛煙霧,房間密閉24h即可)。

(3)干熱消毒:多用于玻璃器皿消毒,干熱烤箱180℃45~60min。

(4)濕熱消毒:培養(yǎng)液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高壓滅菌10min;布類、玻璃制品、金屬器械等用103kPa(121.3℃)高壓滅菌15~20min。

(5)濾過消毒:用孔徑200~450nm大小的濾板可除去培養(yǎng)液和試劑中的細菌和霉菌等。用200nm孔徑的濾板通過兩次,可使支原體達到某種程度的去除,但不能除去病毒。濾器分為負壓和加壓式兩種。過濾的液體量很少時,可選用注射器微量濾膜濾器。

(6)60Co照射:不耐熱的塑料制品或一次性用品的滅菌可經(jīng)包裝后,用γ射線照射消毒。

三、無菌操作

    無菌操作是防止污染、決定培養(yǎng)是否成功的首要條件。由于體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力,在一切操作中要努力做到zui大限度的無菌。工作前對手部需清洗消毒,進無菌操作室時戴口罩和穿工作服。不能用手直接觸及已消毒器皿內部。打開培養(yǎng)瓶前或封閉瓶口前須火焰燒灼瓶口等。

四、取材

    取材應注意無菌操作,防止污染。污染組織應放入含兩性霉素B(2μg/ml)、青霉素(500u/ml)、鏈霉素(500μg/ml)的培養(yǎng)液中浸泡10~20min。取材后應立即進行培養(yǎng)。如因故不能培養(yǎng)時,應在無菌條件下,把組織塊切成1cm3大小置于培養(yǎng)液中37℃貯存。存放時間不宜超過24h。

1. 源自人體的腫瘤和其他病理組織的取材、貯存和運送須注意防止污染。

2. 取血:多采用靜脈血,注意無菌操作,如需應用肝素等抗凝劑,也要注意消毒處理。血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液,可采用離心法分離,500~1000r/min,離心5~10min即可。

3. 動物組織:動物皮毛易隱藏微生物,且不易消毒,應特別注意無菌操作。

五、細胞分散法

1. 機械分散 對于腦、胚胎、腫瘤等軟組織,先用組織勻漿器研磨組織,再通過細胞篩獲得單細胞懸液。

2. 胰蛋白酶消化 適合于消化間質較少的軟組織,傳代細胞消化也常采用,是應用較廣泛的消化酶,由于Ca2+ 和Mg2+ 對胰蛋白酶活性有一定抑制作用,因此須用不含這些離子的緩沖液配制。將組織剪成1mm3大小,置于容器中,加入30~50倍體積的0.25%胰蛋白酶液,消化30~60min。

3. 膠原酶消化 對膠原有較強的消化作用,適用消化纖維組織、上皮組織及瘤組織等。膠原酶的使用終濃度為200U/ml或0.1~0.3μg/ml,其消化作用緩和。一般將3~5倍膠原酶溶液加入已剪碎的組織塊中,數(shù)小時或10余小時后,可見組織塊逐步變小至幾乎看不見,原來澄清的消化液轉變成混懸液時,可以終止消化,如組織塊較大、細胞量較多時,可于消化期間換消化液一次。消化液經(jīng)低速離心5min后,去上清液,加入20%小牛血清培養(yǎng)液,輕輕打散細胞團,制成細胞懸液。

4. EDTA溶液分散 使用濃度為0.02%的EDTA溶液。常用于傳代細胞的消化,作用溫和,毒性小。

六、淋巴細胞分離法

   取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀釋后,沿試管壁慢慢加入4ml淋巴細胞分離液之表面,勿與分離液混合。然后2000r/min水平離心20min,管內分4層,自上而下依次為血漿、單個核細胞(位于細胞分離液上界與血漿下界的中間呈白色霧狀層)、顆粒白細胞(位于淋巴細胞分離液下界與底層紅細胞上界的交界處)和紅細胞(位于管底)。用毛細吸管沿管壁輕輕吸出的淋巴細胞層。然后用Hanks液洗兩次,每次2000r/min離心10min,zui后計數(shù)供用。

七、細胞計數(shù)

   待測細胞懸液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%臺盼藍0.1ml(死細胞著色),混合后滴入血球計數(shù)板內。于低倍鏡下計數(shù)4角的4個大方格內的活細胞(透明未著色)總數(shù),然后用下式計數(shù):

細胞數(shù)/每毫升原液=(4大方格內活細胞數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)

細胞存活率=(活細胞數(shù)/活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%

在計數(shù)時遇到對大方格壓線的細胞,應按數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右的原則進行計數(shù)。

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