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晶抗生物深度剖析ELISA試劑操作常見問題及解決方案
更新時間:2023-04-04   點擊次數(shù):701次

一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作?

溫度是ELISA試劑盒結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng),實驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫,包括檢測樣本。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

二、如何獲得良好線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線?

按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心,收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品溶解和混勻(大約10min),然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟,確保每一步都充分混勻且精確移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、ELISA實驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔?

為獲得更準(zhǔn)確的實驗結(jié)果,強烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。因為復(fù)孔檢測可以:

計算平均值,確保實驗結(jié)果更準(zhǔn)確;

解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;

計算CV值,對實驗的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。

四、為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?

振蕩孵育使反應(yīng)更充分,振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。

孵育過程振蕩,可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸,使得反應(yīng)過程更加完善,OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩,可以使洗板更干凈,在很大程度上 能降低背景值,同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

五、何時終止ELISA反應(yīng)?

ELISA實驗終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成,在佳時間終止反應(yīng)是ELISA試劑盒實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應(yīng)系統(tǒng)中,S5出現(xiàn)淡藍(lán)色,S1 – S3有明顯的階梯型藍(lán)色,便需要終止反應(yīng);或者根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來決定,OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

六、為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時必須選用雙波長?

首先,酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min,使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次,ELISA實驗采用雙波長測定吸光度,可以排除單波長檢測時的測定干擾(標(biāo)本的濃度,干擾色等)。一般采用大波長作為參照波長,在參照波長下,檢測物的吸光值小,檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此,雙波長測定,可大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差,以保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。


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