原代細(xì)胞是指直接從機(jī)體取出的組織或細(xì)胞獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞.這里的組織主要指:組織器官、外周血及胚胎等.由于原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,繁殖一定的代數(shù)停止生長(zhǎng).所以一般認(rèn)為:培養(yǎng)的原代的1代和傳代到10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。晶抗生物為大家總結(jié)了原代細(xì)胞的提取的整個(gè)操作過程,一起來看看吧!
原代細(xì)胞的提取的整個(gè)操作過程:
1.整個(gè)操作要在潔凈通風(fēng)的超凈臺(tái)下進(jìn)行,所有的器材要高壓消毒。2.根據(jù)BALB/c小鼠的體重,用10mlkg3%濃度的麻醉;將小鼠置于盛有75%乙醇的燒杯內(nèi),這一步不僅可以消毒,也可以讓小鼠體毛浸濕,后續(xù)制去皮毛的時(shí)候不會(huì)沾到剪刀或組織上。
3.用鑷子輕輕挑起小鼠的心臟,裝有公共廣播公司的注射器插入心尖,同時(shí)在右心耳處剪開一個(gè)小口,緩慢推動(dòng)注射器,隨著心臟的跳動(dòng),將體內(nèi)的血液沖洗出來。
4.取出小鼠的肺部組織,將肺組織切成小米粒樣的大小,置于預(yù)冷的Hbss中反復(fù)沖洗幾次。
5.將小米粒大小的肺組織置于培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶一天用1%明膠溶液包被培養(yǎng)面,4度過夜,小鼠處理,將培養(yǎng)瓶放置培養(yǎng)箱中,使其溫度恢復(fù)至37度),置于培養(yǎng)箱37度的環(huán)境下,消化4個(gè)小時(shí)。
6.消化4小時(shí)后,加入RPMI1640培養(yǎng)基(有10%血清、1%雙抗、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)10M|(添加培養(yǎng)基,可以是正常培養(yǎng)時(shí)的2倍量),繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)(繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞貼壁情況適當(dāng)調(diào)整)。
7.24小時(shí)后,取出肺組織,鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),換液。
8.原代細(xì)胞的提取和培養(yǎng)是很慢的過程,一般需等到24小時(shí)后,才能在鏡下看到些許細(xì)胞群,一周到兩周后才會(huì)看到鵝卵石樣的排列情況。
9.原代細(xì)胞2-3天換液一次,因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層時(shí),會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象.所以,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層時(shí)就可以傳代了,不要等到長(zhǎng)得非常滿。
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